Vào ngày 29 tháng 9 năm 1998, hai tháng sau sự kiện Resident Evil đầu tiên[18], hầu hết công dân của cộng đồng miền núi Trung Tây Mỹ Raccoon City đã bị T-virus biến thành xác sống, một vũ khí sinh học do công ty dược phẩm Umbrellabí mật phát triển.[19][20] Leon S. Kennedy, một sĩ quan cảnh sát trong ngày đầu tiên làm nhiệm vụ và Claire Redfield, một sinh viên đại học đang tìm anh trai Chris, lên đường đến Sở cảnh sát Raccoon.[19] Họ phát hiện ra rằng hầu hết lực lượng cảnh sát đã bị giết[21], và Chris đã rời khỏi thị trấn để điều tra về trụ sở của Umbrella ở Châu Âu[22]. Họ tách ra để tìm kiếm những người sống sót và tìm cách thoát khỏi thành phố.[23][24] Trong khi tìm lối thoát, Claire gặp một cô bé, Sherry Birkin, đang chạy trốn khỏi một sinh vật lạ, và Leon gặp Ada Wong, cô nói đang đi tìm bạn trai là John, một nghiên cứu viên của Umbrella Chicago.[23][25]

Giám đốc cảnh sát thành phố Raccoon, Brian Irons, đã bị Umbrella mua chuộc nhằm che giấu bằng chứng về các thí nghiệm của công ty ở ngoại ô thành phố. Ông cũng che giấu sự phát triển của họ về chủng G-virus mới, một tác nhân có khả năng biến con người thành sinh vật học tối thượng[23][26]. Leon có nhiều cuộc chạm trán với một con quái vật gọi là Tyrant, được thả xuống Sở cảnh sát Raccoon bởi Umbrella nhằm tìm kiếm G-virus. Irons cố gắng giết Claire nhưng lại bị giết bởi một dị nhân G-virus trong sở cảnh sát. Sau đó, Claire và Sherry trốn xuống hệ thống cống rãnh và bị chia tách. Sau khi chia tay với Leon, Ada đến gặp Sherry và nhặt được một mặt dây chuyền vàng mà cô gái đánh rơi trên đường chạy trốn. Đi sâu vào hệ thống cống ngầm, Ada miễn cưỡng lập nhóm với Leon một lần nữa, sau khi anh khăng khăng muốn bảo vệ cô. Họ bắt gặp một người phụ nữ trung niên, bà ta bắn Ada, nhưng Leon lao vào giữa họ và tự mình lãnh một viên đạn. Ada phớt lờ Leon đang bất tỉnh và đi theo người phụ nữ, bà tiết lộ bà chính là mẹ của Sherry, Annette, và là vợ của William Birkin, nhà khoa học của Umbrella, người đã tạo ra G-virus Trong một nỗ lực cuối cùng để bảo vệ thành quả của ông ta khỏi các đặc vụ của Umbrella, ông ta đã tự tiêm virus, và biến thành một sinh vật dị hình, "G" và hiện đang đuổi theo Sherry do yếu tố gen di truyền[23]. Annette nhận ra mặt dây chuyền của con gái mình và cố gắng lấy nó từ Ada. Một cuộc chiến xảy ra sau đó, cuối cùng Annette bị ném qua lan can[27]. Ada biết rằng mặt dây chuyền vàng này chứa một mẫu G-virus và sau đó - theo tiếng gọi của cảm xúc - cô trở về với Leon, chăm sóc vết thương của anh.[19][23]

Trong khi đó, Claire đoàn tụ với Sherry và phát hiện ra rằng "G" đã cấy ghép con gái với một phôi thai để chờ sinh sản. Leon, Ada, Claire và Sherry tiến qua một nhà máy bỏ hoang, kết nối với cơ sở nghiên cứu bí mật dưới lòng đất của Umbrella. Một cuộc tấn công của "G" khiến Ada bị thương nặng, và Leon phải tìm khắp phòng thí nghiệm để kiếm thứ gì đó để điều trị vết thương của cô[23]. Anh bị chặn lại bởi một Annette điên loạn, giải thích rằng mối quan hệ của Ada với John chỉ là một phương tiện nhằm để lấy thông tin về Umbrella: Ada là một điệp viên được gửi đến để đánh cắp G-virus cho một tổ chức không xác định[23][28]. Ngay khi Annette chuẩn bị bắn Leon, Tyrant xuất hiện và bà buộc phải rút lui. Ada trở về để cứu Leon và chiến đấu với Tyrant - cả hai rơi vào một hố kim loại nóng chảy - và phải trả giá bằng chính mạng sống của cô. Cô thú nhận tình yêu của mình với Leon, anh bỏ lại phía sau cơ thể bất động của cô. Trong khi đó, Annette cố gắng trốn thoát với một mẫu G-virus khác nhưng bị thương nặng bởi người chồng đột biến. Tuy nhiên, trước khi chết, cô nói cho Claire biết cách tạo ra một loại vắc-xin sẽ ngăn chặn các đột biến do phôi gây ra trong Sherry. Sau khi chuẩn bị thuốc, Leon và Claire đoàn tụ tại một chuyến tàu thoát hiểm khẩn cấp và tiêm cho Sherry vắc-xin, giúp cứu sống cô. Trên đường đi, Leon được hỗ trợ trong việc chấm dứt cuộc chiến với Tyrant đột biến hoàn chỉnh bởi một người phụ nữ bí ẩn và người đó trốn thoát với G-virus G trong mặt dây chuyền[23][29]. "G" -giờ đã bị đột biến thành một khối lúc nhúc thịt và răng nanh- đuổi theo sau Leon và Claire, nhưng bị giết chết khi đoàn tàu kích hoạt tự hủy.[23] Sau khi trốn thoát khỏi thành phố cùng với Sherry, Leon dự định lột trần bộ mặt của Umbrella, trong khi Claire tiếp tục tìm kiếm Chris[23][30]. HUNK, một trong những đặc vụ của Umbrella, hoàn thành nhiệm vụ truy xuất G-virus.[29]